к.х.н. Дробченко С.Н., проф. Кальво А., проф. Сэмюэльс Ф.,
ЗАО «Биоград» Санкт-Петербург; Orgenics PBC, Франция; Orgenics LTD Израиль
Алгоритм ВИЧ-тестирования для получения окончательного ответа включает предварительный скрининг и последующие подтверждение результата (рис 11). Для скрининга применяются ИФА-тесты, обладающие максимальной чувствительностью и высочайшей величиной NPV (предсказание отрицательности - вероятность того, что образец не содержит ВИЧ антитела, когда тест дает отрицательный результат).
Подтверждающие тесты, прежде всего, предназначены для определения достоверности полученного в ходе скрининга результата среди изначально ИФА-реактивных образцов, поэтому они должны показывать максимальную специфичность и самую высокую величину PPV (предсказания позитивности - вероятность того, что образец содержит ВИЧ антитела, когда тест дает положительный результат).
Рисунок 11. Алгоритм анализа ВИЧ
Частица ВИЧ состоит из геномной молекулы ДНК связанной с обратной транскриптазой и защищенной капсидой и оболочкой. Оболочка вируса является основной мишенью антител гуморального отклика на инфекцию. Поэтому большая часть высокочувствительных скрининговых тестов основана на обнаружении антител к антигенам, полученным из компонентов оболочки (env) вируса.
Для того, чтобы отличить истинные положительные результаты скрининговых тестов от ложных, следует проводить повторный анализ с использованием подтверждающего теста, имеющего более высокую специфичность, чем скрининговые. Наиболее часто используемый для этих целей Вестерн Блот представляет собой нитроцеллюлозную мембрану, на которую нанесены электорофоретически разделенные белки ВИЧ. В результате многоступенчатого ИФА на мембране проявляются в виде отдельных полос все главные белковые цепочки, закодированные тремя структурными генами ВИЧ (gag, pol и env). Антитела сыворотки избирательно связываются с разными протеинами ВИЧ согласно их специфичности (рисунок 11). Вестерн Блот, являющийся первым принятым подтверждающим ВИЧ методом, принят за Золотой стандарт. Однако, в сравнении с сильно упрощенными ИФА тестами, Вестерн Блот остается более длительным и сложным в постановке анализом. Фирмой Orgenics (Франция, Израиль) был разработан быстрый простой подтверждающий тест ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм. В наборе ВИЧ 1+2 КомбФирм для быстрого серологического определения профиля ВИЧ антител используется пять индивидуальных рекомбинантых и синтетических ВИЧ антигенов. Из них два – протеины, полученные из ферментов вируса (pol)и ядра (gag) - реактивны по обоим типам ВИЧ; остальные три антигена - пептиды или гликопротеиды, производные структурных белков (env), - специфичны по ВИЧ-1 либо по ВИЧ-2. Антигены в определенной концентрации нанесены в индивидуальных позициях и свободны от тканевых антигенов, которые обычно загрязняют препараты из вирусных лизатов, обычно используемых в Вестерн Блот. Результаты анализов с помощью ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм сопоставимы с результатами, получаемыми методом Вестерн Блот. Вместо того, чтобы проделывать два, занимающих много времени анализа Вестерн Блот, можно провести подтверждающий анализ на антитела к ВИЧ типов 1 и 2 с помощью одного быстрого и простого теста КомбФирм.
ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм - это метод рекомбинантного иммуноблота, основанного на непрямом твердофазном иммуноферментном анализе. Твердой фазой является гребень с 6-ю парами зубцов, с шестью точками на каждой паре (по 3 точки на каждом зубце). Верхняя точка левого зубца сенсибилизирована человеческими иммуноглобулинами (внутренний контроль); средняя - рекомбинантным белком p24(gag ВИЧ 1 и ВИЧ 2); нижняя - рекомбинантным антигеном p31 (pol ВИЧ 1 и ВИЧ 2). На правый зубец нанесены: рекомбинантный гликопротеин gp120 (env ВИЧ 1), синтетический пептид gp41 (env ВИЧ 1),синтетический пептид gp36 (env ВИЧ 2) (рисунок 12).
Рисунок 12.
Рисунок 13. Результаты анализов подтверждающих тестов
Проявочная Ванна имеет 6 рядов (A - F), каждый ряд содержит готовые к использованию растворы реагентов для различных стадий анализа (рисунок 1). Анализ проводят в несколько этапов. Гребень последовательно переносят из одного ряда ячеек в другой с инкубацией на каждом этапе.
Рисунок 14. Проявочная ванна
Перед началом анализа образцы сыворотки или плазмы добавляют к растворителю в ячейках ряда A Проявочной Ванны. Затем в ячейки ряда A вставляют Гребень. Анти-ВИЧ антитела, если они присутствуют в образце, специфически связываются с ВИЧ антигенами на зубцах Гребня. Иммуноглобулины, присутствующие в каждом образце, связываются с античеловеческими IgG в верхней контрольной точке левого зубца (Внутренний Контроль) (Рисунок 15). Несвязанные компоненты смываются в ячейках ряда B. В ячейках ряда C анти-ВИЧ IgG и человеческий иммуноглобулин, связанные с точками зубцов, будут взаимодействовать с анти-человеческими IgG антителами мечеными щелочной фосфатазой (alkaline phosphatase AP). В следующих двух рядах ячеек не связавшиеся компоненты удаляют промывкой. В ячейках ряда F связанная щелочная фосфатаза взаимодействует с хромогенными компонентами. Результаты анализа наблюдают в виде серо-голубых пятен на поверхности зубцов Гребня, проявляющихся в зависимости от наличия в исследуемом образце специфических антител (рисунок 15).
Рисунок 15. Принцип анализа КомбФирм
В набор входит Положительный Контроль (антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2) и Отрицательный Контроль которые необходимо ставить при анализе каждой группы образцов. По завершению анализа, на зубцах с Положительным Контролем должны проявиться шесть (по три на каждом) серо-голубых точек. На зубце с Отрицательным Контролем должна появиться только верхняя точка на левом зубце. Интерпретация анализа ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм представлена в таблице 33.
Таблица 33. Интерпретация результатов анализа ВИЧ 1+2 КомбФирм
Конфигурация точек на | Интерпретация | |
Левом зубце | Правом зубце | |
p 24 и / или p 31 * | gp 41 | Положительный ВИЧ-1 |
p 24 и / или p 31 * | только gp 36 или вместе с gp 41 | Положительный ВИЧ-2 |
p24 и / или p31 * |
gp36 и gp и g120 |
Положительный только ВИЧ-1 или совместное инфицирование ВИЧ-2 |
p24 и / или p31 * | Нет точек или gp120 | Неопределенный |
Нет точек * и / или gp36 | gp41 или gp120 | |
Нет точек * | и gp41 и gp120 | |
Нет точек * | Нет точек | Отрицательный |
*) Во всех образцах и контролях должно проявиться верхнее пятно левого зубца (внутренний контроль), в противном случае результаты анализа недействительны и анализ следует повторить.
Как видно, ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм прост в обращении и интерпретации результатов. Если проявится только одна точка внутреннего контроля, то результат теста отрицательный. Две или более точки (включая, по крайней мере, один структурный белок оболочки env) указывают на ВИЧ 1 и / или ВИЧ 2 инфекцию. Остальные результаты считаются неопределенными.
Исследования, проведенные в Израиле, Франции, Бельгии, Бразилии и Сенегале (таблица 34), показали, что ВИЧ 1+2 КомбФирм позволяет получать быстрые результаты со 100% чувствительностью и специфичностью и корректно дифференцирует ВИЧ 1 и ВИЧ 2 в 85.6% случаев. Тест-система может также определить все субтипы 0 образцов ВИЧ 1 985 образцов, идентифицированных хотя бы по одному из двух тестов ELISA третьего поколения, как положительные по ВИЧ-1 и /или ВИЧ-2, были повторно исследованы на подтверждающих тестах ВИЧ 1+2 КомбФирм, а затем Вестерн Блот для ВИЧ-1 (Cambridge Biotech) и для ВИЧ-2 (BioGenex).
Таблица 34. Совокупные, по нескольким центрам, результаты клинических испытаний набора КомбФирм.
ELISA | Вестерн Блот | КомбФирм | |||||
Отриц. | ВИЧ-1 | ВИЧ-2 | ВИЧ 1+2 | Неопределенный | |||
Положительный | Отрицательный | 260 | 242 | 0 | 0 | 0 | 18 |
ВИЧ-1 | 424 | 0 | 409 | 0 | 0 | 15 | |
ВИЧ-2 | 175 | 0 | 0 | 151 | 17 | 7 | |
ВИЧ-1 и ВИЧ-2 | 9 | 0 | 0 | 0 | 9 | 0 | |
Неопределенный | 117 | 54 | 6 | 0 | 0 | 57 | |
Всего | 985 | 297 | 415 | 151 | 26 | 97 |
Была также доказана высокая надежность тест-систем ВИЧ 1+2 КомбФирм, показавшей 100% величину предсказания позитивности, при определении этой величины, среди популяции с низким уровнем распространенности ВИЧ (менее 0.01%).
Клиническая ценность тест-систем ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм была изучена в Бельгии при сравнительных испытаниях с Вестерн Блот. Критерием оценки служила корректность интерпретации неопределенных результатов.
Для исследования анализировали 4 группы образцов:
- 50 образцов положительных по ELISA, получивших положительное подтверждение по Вестерн блот.
Эта группа определяет чувствительность теста, а именно: отношение количества образцов, идентифицированных как положительные, к общему количеству положительных образцов.
- 50 образцов, отрицательных как по ELISA так и по Вестерн блот.
Эта группа определяет специфичность теста, а именно: отношение количества образцов, идентифицированных как отрицательные, к общему количеству отрицательных образцов.
- 50 образцов положительных по ELISA и неопределенных по Вестерн Блот.
- 50 образцов положительных по ELISA и отрицательных по Вестерн Блот.
Группы 3) и 4) соответствуют реальной лабораторной ситуации, когда проводят подтверждающие проверки ELISA положительных образцов. Поэтому эти группы объединены в одну. В этой группе Вестерн Блот определил только 50 образцов как отрицательные, ВИЧ 1+2 КомбФирм выявил 66 образцов как действительно отрицательные, что затем было подтверждено другими методами. Это ясно указывает на то, что ВИЧ 1+2 КомбФирм превосходит Вестерн Блот в предсказательной силе истинно отрицательных образцов, демонстрируя высокую специфичность.
Проведенные исследования показали, что ВИЧ 1+2 КомбФирм уменьшает на 56% число повторных анализов по сравнению с Вестерн Блот, отсеивая ложно неопределенные результаты.
Внедрение ВИЧ 1+2 КомбФирм может повысить эффективность использования ВИЧ-подтверждающих тестов по следующим причинам:
- Обеспечивает максимальную безопасность персонала от заражения использованием при производстве специфических рекомбинантных и синтетических белков,.
- Оптимальная комплектация тест-систем, исключет использование дополнительного оборудования и стадию подготовки растворов.
- Высокая точность, быстрота и гибкость теста.
Последние две причины особенно существенны для небольших медицинских учреждений, получающих с оснащением наборами ВИЧ 1+2 КомбФирм возможность проводить референс исследования.
В таблицах 35, 36 приведены параметры тестов иммуного блота для выявления ВИЧ инфекции.
Таблица 35. Сравнение Вестерн Блот и КомбФирм
Параметры | ВИЧ Вестерн Блот |
RIBA | КомбФирм ВИЧ |
Принцип | косвенный ИФА | косвенный ИФА | косвенный ИФА |
Антигены | сырой вирусный лизат | синтетические | синтетические |
Время анализа | от 3 до 24 часов | ~ 6 часов | 1 час |
Разведение образца | Да | Да | Нет |
Специфичность | ~ 100% | ~ 100% | ~ 100% |
Чувствительность | ~ 99% | ~ 100% | ~ 100% |
Таблица 36. Коммерческие наборы для подтверждения ВИЧ инфекции
Набор | Chrion RIBA HIV-1/HIV-2 SIA | Ortho HIV-1 WB Avidine-Biotine | Cambridge Biotech | Pasteur New Law Blot Ac-Ab-Ak | BioRad | Orgenics КомбФирм HIV 1+2 |
Принцип | RIBA | Вестерн Блот | Вестерн Блот | Вестерн Блот | Вестерн Блот | RIBA |
Время анализа | 5ч. 30мин. | 17-23 ч. | 5ч. | 3ч 40мин. | 2ч. | 1ч. |
Число шагов | 8 | 8 | 8 | 6 | 7 | 6 |
Приготовление реагентов | Промывочный буфер Субстрат |
Промывочный буфер Инкубационный буфер 2 Субстрата конъюгации |
Промывочный буфер Инкубационный буфер Субстрат конъюгации |
Промывочный буфер | Промывочный буфер Субстрат конъюгации |
Нет |
Объем образца | 20 ml | 20 ml | 20 ml | 20 ml | 30 ml | 50 ml |
Как видно из таблиц 35, 36 тесты ИммуноКомб являются безопасными, надежными, удобными и быстрыми тестами, подтверждающими наличие антител к ВИЧ в крови. К их преимуществам также относят непродолжительное время проведения анализа, возможность визуального учета реультатов реакции, наличие внутреннего контроля постановки анализа и т. п.. Приказом №292 от 30.07.2001 тесты «ИммуноКомб II ВИЧ 1+2 КомбФирм» рекомендованы для постановки окончательного лабораторного диагноза и подтверждения наличия антител к ВИЧ методом иммуного блота (также см. главу VII).
Демонстрация позитивных характеристик тест-системы ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм должна способствовать внедрению песледней в практику лабораторных анализов в качестве подтверждающего теста.
Оглавление
Чтобы просмотреть текст книги нажмите на нужную главу в оглавлении
Следующая часть
Глава XIII. Опыт работы с быстрыми простыми тестами в России
Предыдущая часть
Глава XI. Общие инструкции по постановке быстрого простого теста
Внешний вид