Г.И.Улейская, А.А.Борисов, Н.Ю.Мицкевич
Больница 31, Санкт-Петербург

В современной практике лабораторной диагностики вирусных гепатитов используется дифференциальная ИФА-диагностика пяти нозологических форм вирусных гепатитов: А, В, С, D, E. Метод ИФА характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью, сочетающимися с быстротой и простотой исследования. В настоящее время на рынке диагностических препаратов представлено большое количество отечественных и импортных тест-систем. В повседневной практике работы лечебно-профилактических учреждений возникают ситуации, при которых необходимо выполнение лабораторных исследований единичных проб в кратчайшие сроки. Широко используемые диагностические тест-системы требуют в целях экономической целесообразности накопления исследуемого материала. Такая практика приводит к задержке выдачи результатов исследований на несколько дней, что затрудняет дифференциальную диагностику заболеваний. Направление исследуемого материала в централизованные региональные лаборатории приводит к большим финансовым затратам ЛПУ и также удлиняет сроки получения результата. В связи с этим в практику нашей лаборатории внедрены экпресс-методы ИФА-диагностики вирусных гепатитов с использованием тест-систем «ImmunoComb»ЗАО «Биоград».

...

Международные испытания тест-систем, предназначенных для выявления вирусных гепатитов, способствуют совершенствованию диагностики: повышению чувствительности и специфичности, увеличению процента ранней диагностики [35,42-51]. В 1992 году референс - лаборатория Нидерландов совместно с Европейской группой разработала стандарты генодиагностики вирусных гепатитов [52]. С этого времени, по стандарту World White, панели сывороток, используемые при международных испытаниях диагностических систем, должны содержать образцы из различных регионов Азии, Африки, Америки и Европы. В них представлены антитела к вирусам гепатитов различных генотипов, что позволяет определять диапазон диагностики вирусных гепатитов. Трудности определения возбудителя гепатита С относятся к характеру иммунного ответа, который характеризуется, как Автоиммунный феномен и проявляется в очень коротком времени и низком титре антител класса IgM с одной стороны, и низком титре нерегулярных изотипов антител класса IgG к структурным и неструктурным белкам с другой стороны. Этот факт заставляет поднимать чувствительность существующих Elisa-тестов 3-ей генерации. Наборы ИммуноКомб 3-ей генерации основаны на различных антигенах, сенсибилизированных в разных точках зубца гребня.

После появления в 1985 году серологических тестов для определения антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ), было написано огромное количество статей об их рабочих характеристиках, точности, стабильности при использовании в различных ситуациях. Наличие огромного количества различных видов тестов обусловлено продолжающимися попытками добиться от них чувствительности и специфичности, обеспечивающих диагностику инфекций на ранних стадиях; подтверждения сомнительных результатов; определения инфекции у новорожденных, а также таких характеристик, как простота действия и эффективность затрат, возможности использования для альтернативного скрининга и подтверждающих стратегий.

к.м.н. Голиусов А.Т. - начальник отдела надзора за ВИЧ/СПИД Федеральной Службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ

Распространение ВИЧ-инфекции остается одной из актуальных проблем и представляет реальную угрозу социальному и экономическому развитию страны. Показатель числа инфицированных ВИЧ на 100 тыс. населения вырос от 21,0 в 2001 г. до 157,0 в 2003 г. На большинстве территорий основным путем заражения остается внутривенное потребление наркотиков. Вместе с тем, начиная с 2001 г., увеличивается число заразившихся половым путем. Во многом это связано с особенностями современной действительности, например, с развитием рынка сексуальных платных услуг. Изменилась общая структура ВИЧ-инфицированных. Значительно возросла доля женщин фертильного возраста. Среди ВИЧ-инфицированных рожениц, каждая четвертая не наблюдалась по поводу беременности, а наличие ВИЧ-инфекции выявлялось только при поступлении на роды. Следствием бурного распространения ВИЧ-инфекции стало резкое увеличение случаев её выявления среди призывников. Число ВИЧ-инфицированных в учреждениях пенитенциарной системы в 2002 году возросло в 5 раз по сравнению с 1999 годом [6].

к.х.н. Дробченко С. Н., проф. Кальво А., проф. Ривац Б., проф. Фиш Ф., проф. Финк А., к.м.н. Марголин О.
ЗАО «Биоград», Санкт-Петербург; Orgenics PBS, Франция; Orgenics LTD, Израиль

В своих рекомендациях ВОЗ выделяет три главных направления использования иммуноферментных тестов:

• ​Скрининг доноров крови, органов и тканей.
• Эпидемиологический надзор над зонами с повышенным риском заражения ВИЧ-инфекцией.
• Диагностика и постановка диагноза индивидуумам.

к.х.н. Дробченко С. Н., проф. Кальво А., проф. Ривац Б., проф. Фиш Ф., проф. Финк А., к.м.н. Марголин О.
ЗАО «Биоград», СПб; Orgenics PBS, Франция; Orgenics LTD, Израиль

С 1985 года, с момента обнаружения ВИЧ, данная инфекция попадает под особый контроль во всех странах мира. Постоянно совершенствуются методы диагностики и регулярно проводятся контрольные испытания существующих тестов на ВИЧ. При этом, появление новых сведений об инфекции заставляет ведущих производителей дорабатывать технологические схемы производства диагностикумов.

к.х.н. Дробченко С.Н., проф. Кальво А., проф. Ривац Б, проф. Сэмюэльс Ф., проф. Финк А., к.м.н. Марголин О.
ЗАО «Биоград» СП; Orgenics PBS, Франция; Orgenics LTD Израиль.

Все производители диагностикумов для получения разрешения на продажу своей продукции проходят полную Процедуру соответствия стандарту, выработанному Техническим комитетом 140 Европейского комитета по стандартизации (CEN)[53-59] и клинические испытания согласно prEN 13612[60] с использованием подробно разработанного протокола исследований, основанного на широко известных указаниях, таких как NCCLS[61-70].

Аналитическая чувствительность отражает наименьшее количество (концентрацию) обнаруживаемого вещества в исследуемом материале.

Аналитическая специфичность определяется, как способность теста обнаруживать только искомое вещество или его маркер.

...

Согласно требованиям CTS, системы, разрешённые для использования в Европе, обязаны учитывать эффекты кросс-реактивности, наличие которых зависит от состава реагента и конфигурации теста. Исследование возможных перекрёстов должно входить в риск-анализ каждого теста. Перекрестное взаимодействие может быть вызвано, например, следующим:

• Образцы, представляющие сходную инфекцию Specimens representing related infections.
• Образцы от мультипар (т.e.: женщины, имевшие более чем одну беременность или пациенты, позитивные по ревматоидному фактору)
• Для рекомбинантных антигенов, антитела к компонентам of the expression system (e.g., anti–E. coli, or anti-yeast).

Согласно CTS, тесты, предназначенные для исследования сыворотки и плазмы, должны одинаково хорошо работать с обоими материалами, при этом должны быть учтены все антикоагулянты и потенциально взаимодействующие соединения

Оценка работы ИммуноКомб была произведена на основании не менее 50 заборов крови для каждой инфекции. Образцы крови были помещены в вакунтейнер-трубки, содержащие EDTA, Цитрат или Гепарин (Citrate, Heparin) и для контроля в трубки, не содержащие антикоагулянтов; центрифугированы (3000 об/мин или 5000 об/мин). Затем были отделены плазма или сыворотка.

Для проверки воспроизводимости результатов анализа на разных зубцах гребня по 10 гребней одной и той же серии помещались в ванночки с одним и тем же положительным образцом. Результаты анализировались визуально и на приборе КомбСкан. Процент отклонения результатов был не более 11,4 %. Это подтверждает гомогенность зубцов каждого гребня. Более того, процент отклонений величины абсорбции на индивидуальном зубце разных гребней не превышал 9,8 %. Это указывает на гомогенность гребней всех наборов данной серии.

Следует особенно подчеркнуть воспроизводимость результатов, полученных на тест-системах ИммуноКомб разных серий. Как пример, в таблице приведена воспроизводимость результатов анализа на тест-системах ИммуноКомб ВИЧ 1+2 Биспот:

Для проверки стабильности наборы ИммуноКомб были помещены в рекомендованные для хранения условия (2-8 ^oС) и с интервалами 3, 6 и 12 месяцев исследовалась их чувствительность.

Полученные данные показали, что ИммуноКомб не теряет чувствительности как минимум 12 месяцев (срок хранения 12 месяцев). Также чувствительность тестов практически не менялась при хранении их в течение 7 дней при температуре +37^oС.

Хранение наборов в течение 13 дней при температуре +37 ^oС. снижало чувствительность лишь на 16,4%.

Все полученные жалобы немедленно регистрируются в базе службы Контроля Качества, с последующим уведомлением об этом всех сотрудников службы. Наборы из каждой серии продукции хранятся на складе до истечения срока хранения с целью возможности перепроверки и ответа на запросы потребителей. Сразу после поступления жалобы на набор (за исключением жалоб, связанных с транспортировкой) все оставшиеся наборы той же серии проходят повторный (усиленный) контроль качества. После того как были проанализированы жалобы, полученные за последние годы, они были разделены на два вида – подтвержденные и неподтвержденные. Подтвержденные жалобы – жалобы, вызванные не ошибкой пользователя набора, всегда полностью исследуются (повреждения во время транспортировки, ошибка производителя). Неподтвержденные жалобы – жалобы на не корректную работу набора, вызванную неправильной эксплуатацией, несоблюдением условий хранения или истекшим сроком годности.

В ходе испытаний тест-систем ИммуноКомб, имевших целью подтверждения соответствия последним международным стандартам качества и получения международных аттестационных сертификатов, были получены следующие результаты:

• Аналитические и клинические показатели тест-систем ИммуноКомб удовлетворяют предъявляемым требованиям CTS, демонстрируя чувствительность (100%) и специфичность (более 99,5%) , сравнимые с аналогичными показателями референс-тестов третьего поколения.
• Подтверждена строгая специфичность тест-систем ИммуноКомб при анализе кросс-реактивных образцов. Специфичность составила более 99,5%.

...

к.х.н. Дробченко С. Н., проф. Кальво А., проф. Фальк Ф.
«Биоград», СПб; Orgenics PBS, Франция

В рамках своей работы ВОЗ периодически изучает и контролирует качество различных быстрых простых тестов (см. главу II), давая рекомендации по их применению. Наиболее подходящие тесты, отвечающие высоким требованиям качества, ВОЗ задействует в своих программах, реализуемых по всему миру. Для получения сертификата СЕ свободной продажи по Европе все производители диагностикумов проходят сложную процедуру контроля производства и качества выпускаемой продукции (см. главу V). Кроме этого, официальная организация AMREF-DSM (Франция) периодически проводит сравнительные испытания разрешенных для продажи в Европе диагностикумов. Цель данных испытаний повысить эффективность и рентабельность программ, т.е. отдать приоритет тем тест-системам, чьи определенные сравнительные характеристики (показатели) были оптимальны при постановке конкретных анализов.

д.м.н., проф., Воробьева М.С., Заведующая лабораторией стандартизации и контроля МИБП против арбовирусных инфекций, риккетсиозов и СПИДа, ГИСК им. Л.А.Тарасевича

Диагностика ВИЧ-инфекции, обычно, базируется на выявлении антител к ВИЧ. Классические серологические тесты для выявления антител к ВИЧ делятся на тест-системы для скрининга антител (первичная диагностика) и тест-системы для подтверждения, т.е. идентификации ВИЧ – позитивных образцов сывороток крови человека.

Проведение обследования единичных тестов на ВИЧ необходимо в регионах с низким показателем распространения ВИЧ-инфекции. При этом требуется использовать высокоспецифичные, одноразовые тесты для индивидуального обследования единичных сывороток крови человека.

д.м.н., проф., член-кор. РАЕН Михайлов М.И., Руководитель лаборатории индикиции ГУ института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Руководитель отдела вирусных гепатитов ГУ института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН

Прогресс в исследовании и профилактике большинства инфекционных заболеваний во многом определяется разработкой и внедрением новых методов лабораторной диагностики. Не исключением являются вирусные гепатиты. Применение иммунохимических методов детекции антигенов и антител (реакция преципитации в геле) позволило идентифицировать «Австралийский антиген» (HВsAg), основной маркер вируса гепатита В (Б. Бламберг, 1964 г.). Обнаружение этого антигена открыло новую эпоху этиологической расшифровки вирусных гепатитов. Вслед за выявлением вирусов гепатита В, А, Е, D и С, при помощи появившихся новых методов молекулярной диагностики идентифицированы новые вирусы (вирус гепатита G; TTV и SEN), которые ответственны за развитие гепатитов, обозначаемых ранее как - гепатиты «НИ А, НИ В».

д.м.н., проф., Жибурт Е.Б., Заслуженный рационализатор Российской Федерации, Директор Центра крови Минздрава России, Председатель Совета Российской ассоциации трансфузиологов, Председатель Координационного Совета служб крови государств – участников СНГ

Служба крови – отрасль здравоохранения, целью которой является обеспечение качества трансфузионной терапии. Для реализации этой цели учреждения, подразделения и специалисты службы крови во взаимодействии с общественными организациями и медицинскими работниками организуют донорство крови и ее компонентов, производство, транспортировку, хранение и применение компонентов и препаратов крови, клиническое использование технологий, альтернативных аллогенным гемотрансфузиям;

Буравцова Е.В., Начальник КДО Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом

В профилактике передачи ВИЧ-инфекции от матери к ребенку достигнуты большие успехи. При выявлении ВИЧ-инфекции на ранних сроках беременности женщине назначается химиопрофилактика, что снижает вероятность заражения ребенка в 3 – 5 раз.

В идеале все беременные женщины должны проходить тестирование на ВИЧ до родов. Однако не все беременные женщины (особенно из групп повышенного риска заражения ВИЧ) вовремя встают на учет в женских консультациях и проходят обследование на ВИЧ. У таких женщин ВИЧ-инфекция остается не выявленной и при этом упускается возможность предотвратить заражение ребенка и сохранить годы жизни самой женщине благодаря активному лечению. Организация скрининговых обследований рожениц с использованием быстрых простых тестов на ВИЧ позволит женщинам, не прошедшим тестирование во время беременности, получить короткий курс антиретровирусной профилактики и тем самым сократить риск заражения ребенка. По данным множества исследований антиретровирусная профилактика начатая в родах и затем назначенная новорожденному позволяет снизить риск заражения ребенка на 50%.

Наборы ИммуноКомб – простые быстрые тесты, предназначенные для диагностики СПИДА (ВИЧ1 и ВИЧ2), гепатитов A (HAV IgM, HAV Ab), B (HBsAg, anti-HBsAg, HBcIgG, HBcIgM), С (HCV), цитомегалии (CMV IgG, CMV IgM), токсоплазмоза (Toxo IgG, Toxo IgM), хламидиоза (Chlamidia Trachomatis IgG, Chlamidia Trachomatis IgM, Chlamidia Bivalent IgG), краснухи(Rubella IgG, Rubella IgM), гастритов и язвенных заболеваний (Helicobacter Pylori IgG). Типовой набор реагентов позволяет проводить анализ по единому плану, варьируя количество исследуемого образца, длительность и температуру инкубации в зависимости от специфичности набора. Для исследования используют сыворотку или плазму крови человека(в исключительных случаях цельную кровь). Такой унифицированный подход к диагностике различных инфекций намного упрощает подготовку персонала и работу в лаборатории в целом. Методика не требует наличия дополнительного оборудования. все компоненты набора готовы к употреблению. Набор рассчитан на 36 определений, включая два контроля, и может применяться для индивидуального тестирования образцов.

к.х.н. Дробченко С.Н., проф. Кальво А., проф. Сэмюэльс Ф.,
ЗАО «Биоград» Санкт-Петербург; Orgenics PBC, Франция; Orgenics LTD Израиль

Алгоритм ВИЧ-тестирования для получения окончательного ответа включает предварительный скрининг и последующие подтверждение результата (рис 11). Для скрининга применяются ИФА-тесты, обладающие максимальной чувствительностью и высочайшей величиной NPV (предсказание отрицательности - вероятность того, что образец не содержит ВИЧ антитела, когда тест дает отрицательный результат).

Технология твердофазного иммуноферментного анализа ИммуноКомб разработана в институте Пастера (Франция). Производство этих наборов было начато в 1982 году в Явне (Израиль) и в Страсбурге (Франция). Наборы были проверены и одобрены Институтом П.Эрлиха и Институтом А. Фурниэ (Франция).Тест-системы ИммуноКомб были отобраны для программ ВОЗ, Юнеско, Красного креста и поставляются более, чем в 100 стран мир.

д.м.н., проф. Смольская Т.Т., Шилова Э.А., к.м.н. Райская В.А.

Северо-Западный Окружной Центр по профилактике и борьбе со СПИДом, Санкт-Петербург

С конца 1996 года в составе Северо-Западного окружного центра по профилактике и борьбе со СПИДом функционирует кабинет добровольного анонимного обследования на ВИЧ инфекцию («Доверие»).

Основные направления работы кабинета «Доверие»:

• психосоциальное до-тестовое и послетестовое консультирование;
• лабораторная диагностика ВИЧ инфекции, СПИД-ассоциированных инфекций, вирусных гепатитов, а также инфекций, передаваемых половым путем (ИППП);
• направление пациентов для оказания специализированной помощи в медико-социальные учреждения города.

Кожевников, Т. П. Серкина, Г. В. Бодрова
Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИДом, г.Якутск

Вирусные гепатиты занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии и с каждым годом число выявленных случаев гепатитов В и С, зарегистрированных в России, неуклонно увеличивается. Существенную роль для подтверждения диагноза вирусного гепатита играют результаты лабораторных исследований. В настоящее время первичным серологическим методом исследования является иммуноферментный анализ (ИФА), требующий применения высококачественного оборудования. В медицинских учреждениях, не имеющих оборудования, для исследований используются простые и быстрые тесты ИммуноКомб. Эти тесты необходимы при экстренных ситуациях для лабораторий с небольшим количеством исследований.

д.м.н., проф.Огарков П.И., к.м.н. Малышев В.В.
Военно-Медицинская Академия, Санкт-Петербург

Сотрудничество кафедры общей и военной эпидемиологии военно-медицинской академии и фирмы «БИОГРАД» продолжается с 1993 года. За этот промежуток времени сотрудниками кафедры с использованием тест-систем ИммуноКомб проведены сотни исследований в воинских коллективах и лечебных учреждениях в различных регионах страны. Отличительными особенностями диагностикумов «БИОГРАДА» является возможность постановки реакции в полевых условиях (требуется лишь дистиллированная вода и пипеточные дозаторы), широкий диапазон одновременно одним набором тестируемых проб (от 1 до 300) и быстрота получения результатов (через 1,5 часа).

к.м.н. Вашукова С.С.
Городской диагностический центр вирусологии, г.Санкт-Петербург

В Городском Центре вирусологических исследований Комитета по здравоохранению с 1994 года использовались тест-системы ИммуноКомб для диагностики следующих заболеваний:

Совершенствование методов лабораторной диагностики – одно из важнейших направлений на пути борьбы с инфекционными заболеваниями.

Внедрение новой методологии, идущей на смену традиционным подходам, наметило две основных тенденции развития современных методов тестирования:

• Изобретение сложных автоматизированных анализаторов, исследующих образцы по нескольким параметрам одновременно;
• Разработка экспресс-методов, основанных на применении быстрых простых тестов (БПТ).

1. Healy DS, Dax EM An evaluation of two simple synthtic peptide based anti-HIV assays. J Virol Methods; 38, P.305-312, 1992 .

2. Constantine NT, Fox E, Abbatte EA, et ai. Diagnostic usefulness of five screening assays for HIV in an east Afrian city where prevalence of infection is low; 3, P.313-317, 1989.

3. Van Den Berk GE and others. Evaluation of the Rapid Immunoassay Determine HIV 1/2 for Detection of Antibodies to Human Immunodeficiency Virus Types 1 and 2. Journal of Clinical Microbiology ; 41(8), P.3868-3869, August 2003.

...

Методические рекомендации разработаны доктором медицинских наук, профессором, академиком Российской академии медицинских наук Покровским В.В., начальником отдела надзора ВИЧ/СПИД Федеральной Службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ кандидатом медицинских наук Голиусовым А.Т., Доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный рационализатор Российской Федерации, Директор Центра крови Минздрава России, Председатель Совета Российской ассоциации трансфузиологов, Председатель Координационного Совета служб крови государств - участников СНГ Жибурт Е.Б., доктором медицинских наук, профессором, член-кор. РАЕН руководитель лаборатории индикации ГУ института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, руководитель отдела вирусных гепатитов ГУ института полиомиелита и вирусных энцефалитолв им. М.П. Чумакова РАМН Михайловым М.И., профессором, доктором медицинских наук Воробьевой М.С., кандидатом химических наук Дробченко С.Н и коллективом ведущих зарубежных специалистов в области диагностики инфекционных заболеваний.