к.х.н. Дробченко С. Н., проф. Кальво А., проф. Ривац Б., проф. Фиш Ф., проф. Финк А., к.м.н. Марголин О.
ЗАО «Биоград», Санкт-Петербург; Orgenics PBS, Франция; Orgenics LTD, Израиль
В своих рекомендациях ВОЗ выделяет три главных направления использования иммуноферментных тестов:
- Скрининг доноров крови, органов и тканей.
- Эпидемиологический надзор над зонами с повышенным риском заражения ВИЧ-инфекцией.
- Диагностика и постановка диагноза индивидуумам.
Первоначально все обследования проводились по классической схеме: ELISA – анализ с последующим подтверждением Вестерн Блот (ELISA/Вестерн Блот). Последующие исследования показали, что надежность результатов комбинации быстрых простых тестов, таких как ИммуноКомб, агглютинационных тестов, и/или ELISA тест-систем, не уступает, а в некоторых случаях, при использовании быстрых простых тестов, превосходит надежность результатов комбинации ELISA / Вестерн Блот, при значительно меньшей стоимости [3,4,14-18]. Более того, эффективность Вестерн Блот снижалась вследствие того, что он часто давал не интерпретируемые или неопределенные результаты [31].
Впервые в 1992 году ВОЗ представила новую схему скрининга, основанную на комбинации двух отличающихся по составу антигенов ELISA и/или быстрых простых тестов, и минимизирующую использование дорогих подтверждающих тестов [32]. С тех пор выбор тестов существенно расширился. Стремление к увеличению чувствительности иммуноферментных тестов для обеспечения безопасности переливания крови и пересадки органов и тканей, привело к появлению ложно положительных результатов. Поэтому в 1997 году ВОЗ и UNAIDS модифицировали схему тестирования [5], включив в нее 3 стратегию (рис 1).
Выбор стратегии зависит от цели тестирования и от распространенности ВИЧ инфекции в обследуемой популяции (табл.1). В этих стратегиях UNAIDS и ВОЗ рекомендуют использование комбинации быстрых простых тестов и/или ELISA тест-систем вместо комбинации ELISA\Вестерн Блот. ВОЗ неоднократно подчёркивает, что в определённых ситуациях более эффективно применение быстрых простых тестов (RST). Стратегия 1 может быть применена для обследования доноров крови, органов и тканей; при скрининге в зонах повышенного риска (> 10%), при постановке диагнозов в группе зараженных при наличии симптомов (>30%). Для обеспечения безопасности переливания крови и пересадки органов и тканей, ВОЗ рекомендует применение высокочувствительных быстрых простых тестов. Образцы, для которых получен положительный или неопределенный результат на основании одного тестирования, должны рассматриваться как потенциально инфицированные и уничтожаться в соответствии с инструкцией. Стратегия 1, предназначенная для тестирования донорского материала, не должна применяться для постановки окончательного диагноза доноров. В случае если донор должен быть уведомлен о результатах анализа, следует применять стратегию 2 или 3.
Стратегия 2 предназначена для обследования контингента с низким уровнем распространения инфекции (?10%) и для постановки диагноза при наличии симптомов заболевания менее чем у 30%. В зоне с распространенностью инфекции менее 10% для постановки окончательного диагноза пациентам, у которых отсутствуют симптомы ВИЧ, оправдано применение стратегии 3. В соответствии с выбранной стратегией должны быть подобраны тесты, обеспечивающие достоверные результаты. Например, при использовании тестов T1 и T2 для стратегий 2 и 3 следует учитывать, что первый тест должен иметь наивысшую чувствительность, а второй тест должен иметь более высокую специфичность, чем первый. Количество неопределенных результатов не должно превышать 5%.
При этом ВОЗ подчеркивает, что порядок использования быстрых простых тестов или ELISA-тестов исключительно важен для окончательных результатов выбранной стратегии. Если подбору правильной комбинации тестов не уделять достаточно внимания, возможна постановка ложного диагноза.
Таблица 1. Рекомендации ВОЗ и UNAIDS по выбору стратегии тестирования в зависимости от цели тестирования и от распространенности ВИЧ инфекции в обследуемой популяции
Цель тестирования | Распространенность ВИЧ инфекции | Стратегия тестирования | |
Безопасность переливания крови и пересадки органов | любая | 1 | |
Скрининг | >10% | 1 | |
<=10% | 2 | ||
Постановка диагноза | При наличии симптомов ВИЧ | >30% | 1 |
<=30% | 2 | ||
При отсутствии симптомов ВИЧ | >10% | 2 | |
<=10% | 3 |
Рисунок 1. Схема стратегий тестирования, предложенных ВОЗ и UNAIDS
Поэтому сегодня актуальным является подбор наиболее подходящих тестов в зависимости от того, для каких целей и условий они будут использованы. Такой подбор может быть осуществлён на основании изучения характеристик различных тестов. В таблице 2 приведены характеристики тестов различной степени сложности, отобранных для программ ВОЗ [33].
Таблица 2. Характеристики различных тестов
Тип теста (a) |
Количество тестов в наборе | Время анализа ч, мин |
t C° хране- ния |
Уровень сложнос- ти (b) |
Дополнительное оборудование | Чувствительность (%) |
Специфичность (%) |
Серо- конвер- сия (с) |
Цена 1 анализа (d) |
ИФА ELISA | |||||||||
Тест a Тест b Тест c |
96/480 192/576 96/960 |
2.05 2.05 1.35 |
2-8 2-8 2-8 |
4 4 4 |
спец.лаборато-рия, Инкубатор Вошер Ридер Автом.пипетки |
100.0 100.0 100.0 |
98.5 100.0 99.7 |
1.1 0.6 3.2 |
0.60/0.45 0.45 0.43/0.38 |
Агглютационный тест (Agglution test) | |||||||||
Тест d Тест e |
100/220 20/100 |
2.05 0.03 |
2-8 2-8 |
3 3 |
Автом.пипетки Нет |
100.0 100.0 |
100.0 98.8 |
1.0 2.4 |
0.88 2.0/1.2 |
ИммуноКомб (Immunodot/Immunocomb test) | |||||||||
Тест f Тест g |
36 48 |
0.37 0.27 |
2-8 2-8 |
2 2 |
Автомат. пипетки |
100.0 100.0 |
99.7 99.4 |
1.0 4.9 |
1.2 .9 |
Мембранный тест (Flow through membrane test) | |||||||||
Тест h | 10/20/50 | 0.05 | 4-8 | 2 | Нет | 99.6 | 99.7 | 3.0 | 1.2 |
Хромотографический тест (Chromatographic membrane test) | |||||||||
Тест i Тест j |
30 40 |
0.03 0.11 |
2-25 2-8 |
1 1 |
Нет Нет |
98.9 100.0 |
100.0 99.4 |
6.2 2.1 |
1.4 2 |
- Тесты a-j оценены и отобраны ВОЗ
-
- Уровень 1: небольшой или отсутствующий опыт лабораторной диагностики
- Уровень 2: требует предварительной подготовки реагентов
- Уровень 3: особые навыки в приготовлении разведённых серий и интерпретации картины агглютинации
- Уровень 4: обученный персонал и сложное лабораторное оборудование
- Разница в сутках при выявлении позитивного результата в сравнении с референс-тестом
- Оптовая специальная цена для ВОЗ, исключая фрахт и прочие издержки
Как видно из таблицы 2, стоимость отдельного быстрого простого теста выше стоимости одного теста ELISA, однако, в ситуациях, когда требуется провести некоторое количество анализов за небольшой промежуток времени, использование быстрых простых тестов может быть выгодным. Принимая во внимание специфичность, надёжность и воспроизводимость быстрых простых тестов, их использование становится экономически более выгодным, чем использование ELISA.
ВОЗ и UNAIDS для обеспечения национальных программ по контролю за СПИДом и вирусными гепатитами проводит централизованные закупки тестов, дающих наиболее точные результаты при наименьшей возможной цене. Для этого ВОЗ периодически проводит сравнительные испытания предлагаемых тестов.
В этой книге мы приводим данные об одном из таких испытаний, проведённом в Институте по контролю за Инфекционными заболеваниями (Стокгольм, Швеция) [15].
На первом этапе тестировали сыворотки 1110 пациентов, из которых 198 (17.8%) были ВИЧ - серопозитивны: 52 (4.7%) ВИЧ-1, 120 (10.8%) ВИЧ – 2, и 26 (2.3%) ВИЧ-1/ВИЧ-2 кросс-реактивны.
Дополнительно на чувствительность и кросс- реактивность между ВИЧ-1 и ВИЧ – 2 были исследованы ещё 95 отобранных ВИЧ-положительных образцов. В качестве золотого стандарта использовали Вестерн Блот. При этом, кроме оценки и сравнения тестов, была проверена возможность использования для постановки окончательного диагноза комбинации двух различных тестов: ELISA и БПТ(быстрых простых тестов) и двух БПТ разных фирм.
Исследуемый материал вначале проверяли двумя видами иммуно-анализа: Enzygnost ELISA и Capillus БПТ. Образцы, давшие положительную реакцию исследовали повторно следующими тестами: UBI ELISA, Innotest ELISA Recombigen БПТ, Multispot БПТ и ImmunoСomb БПТ. Такие тесты как ИммуноКомб БПТ, Wellcozyme Recombinant HIV-1 ELISA, PEPTI-LAV и INNO-LIA были использованы для дифференциации ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Были получены следующие результаты:
Чувствительность всех тестов - 100%. Специфичность первичных и повторных исследований - 98.0 и 99.7%, соответственно. Различные комбинации 2 или 3 тестов показывали специфичность 100%. При этом было отмечено, что ИммуноКомб и PEPTI-LAV продемонстрировали самую низкую кросс-реактивность.
Последующее исследование 1501 образца показало, что чувствительность и специфичность некоторых быстрых простых тестов сравнима или превосходит аналогичные показатели ELISA и Western blot.
По результатам Сравнительных испытаний ВОЗ отобрала для своих программ быстрые простые тесты[34], зарекомендовавшие себя не только как высоко чувствительные и специфичные, но и наиболее подходящие и удобные для постановки небольшого количества анализов (табл.3)
Таблица 3.Основные характеристики и операции быстрых простых тестов
Наименование | Capillus HIV1/HIV2 |
ИммуноКомб II BISPOT ВИЧ 1,2 |
Microred HIV1 /HIV2 AB test | Simplired HIV1 /HIV2 AB test | Retrocell HIV1 |
Производитель | Cambrige Diagnostics, Ирландия | PBS Orgenics S, Франция, Израиль | Agen Biomedical, Австралия | Agen Biomedical, Австралия | Abbott GmbH Diagnostica, Германия,США |
Тип | Агглютинация ВИЧ-1,ВИЧ-2 |
Иммунодот ВИЧ-1,ВИЧ-2 |
Агглютинация ВИЧ-1,ВИЧ-2 |
Агглютинация ВИЧ-1,ВИЧ-2 |
Агглютинация ВИЧ-1 |
Антиген | Рекомбинант-ные белки | Синтетические пептиды | Синтетические пептиды | Синтетические пептиды | |
Твёрдая фаза | Латексные шары | Пластиковые гребни | эритроциты | эритроциты | стабилизиров. эритроциты |
Количество тестов в наборе | 20/100 | 36 | 192/960 | 25/100 | 100 |
Срок годности (C?) | 9 месяцев (2-8) | 12 месяцев (2-8) | 6 месяцев (2-8) | 12 месяцев(2-8) | 9 месяцев (2-8) |
Объём образца мкл Разведение образца |
10 1:11 |
50 1:2 |
10 1:10 |
10 нет |
10 1:75 |
t анализа Сo | 18-25 | 20-26 | 18-25 | 18-25 | 18-25 |
Время проведения анализа (час, мин) | 0.03 | 0.37 | 0.35 | 0.03 | 3.05 |
Время на проведе- ние 90 анализов | 1.30 | 1.25 | 1.30 | 1.40 | 4.10 |
Результаты | Визуально или автоматизиров. | Визуально или автоматизировано | Визуально | Визуально | Визуально |
Чувствительность% Панель(263 образ.) образцы ВИЧ 1 (203) Африканские (54) Азиатские (40) Европейские (64) Латиноамерикан.(45) Образцы ВИЧ 2 (60) |
100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 |
100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 |
98.5 98.0 94.4 100.0 100.0 97.8 100.0 |
99.2 99.0 96.3 100.0 100.0 100.0 100.0 |
100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 |
Специфичность% Панель(332образц) Африканские(80) Азиатские (59) Европейские (140) Латиноамерик.(53) |
98.8 97.5 98.3 99.3 100.0 |
99.7 100.0 100.0 99.3 100.0 |
93.1 88.8 94.9 92.9 98.1 |
80.4 57.5 89.8 83.6 90.6 |
99.1 100.0 98.3 979 100.0 |
Простота в использовании | Очень простой | Очень простой | Очень простой | Очень простой | Очень простой |
Цена за 1 тест ($США) | 2.2(100 тестов) 2.8(20 тестов) |
1.67 | 1.5(192 тестов) 1.0 (960 тестов) |
4.0(25 тестов) 3.0(100тестов) |
1.45(100 тестов) |
Рекомендовано для использования как | Наиболее подходящие | Наиболее подходящие | Подходящие | Подходящие | Подходящие |
Из таблицы 3 видно, что наиболее подходящими для скрининга являются системы Capillus и ИммуноКомб, а для обследования доноров – ИммуноКомб, так как он более специфичен.
В 1999-2001 году ВОЗ провела сравнительные испытания быстрых простых тестов 10 производителей для обнаружения поверхностного антигена вирусного гепатита B [35]. При этом оценивалась не только чувствительность и специфичность, но и результаты, полученные на сероконверсионных и низкотитражных панелях (см Рис. 2 и 3). Тест-системы ИммуноКомб (ImmunoComb II HBsAG 90’) не только показали высокую чувствительность и специфичность, но и продемонстрировали результаты близкие или превосходящие результаты референс-тестов на сероконверсионных и низкотитражных панелях.
Рисунок 2. Образцы сероконверсионной панели, определяемые каждым из тестов относительно референс-теста Monolisa Ag HBs Plus (0 соответсует первому образцу, определяемому референс-тестом)
Несколько сероконверсионных панелей были протестированы этими тестами. Образец определенный референс-тестом был принят за нулевое значение. Как видно из рисунка 2 системы ИммуноКомб HBsAg 90’ выявляет HBsAg в среднем на 1 сутки раньше, чем референс-тест Monolisa Ag HBs Plus. Все остальные тесты обнаруживают HBsAg, отставая от референс-теста, по крайней мере, на 2 суток.
Количество образцов низкотетражной панели, идентифицированных тестом ИммуноКомб, как содержащих HBsAg, совпадает с количеством образцов, выявленных референс-тестом Hepanostika HBsAg и на один образец меньше, чем референс-тестом Monolisa Ag HBs Plus (рис.3). Количество образцов сероконверсионной панели определенных тест-системами ИммуноКомб, превышает показатель референс-тестов.
Рисунок 3. Сравнительная характеристика тестов при определение образцов сероконверсионных и низкотитражных панелей
Проведенные испытания показали, что чувствительность и специфичность быстрых простых тестов по выявлению поверхностного антигена вирусного Гепатита В не уступает аналогичным характеристикам ELISA тестов. Тесты ИммуноКомб определяют HBsAg на более ранних стадиях и в более низких концентрациях, чем другие участвующие в испытаниях тесты
Сегодня в продаже имеется много разновидностей быстрых простых тестов, имеющих очевидные преимущества. Их качество сравнимо с качеством тестов ELISA. ВОЗ рекомендует использовать надёжные быстрые простые тесты в медицинских учреждениях на всех уровнях здравоохранения. В настоящее время в ряде стран используется набор различных скрининговых тестов применяемых в строго определенном порядке, рекомендуемом ВОЗ и UNAIDS. При этом подтверждающие тесты должны использоваться только в случае неопределенных результатов при диагностировании.
Оглавление
Чтобы просмотреть текст книги нажмите на нужную главу в оглавлении
Следующая часть
Глава III. Результаты международных испытаний тест-систем ИммуноКомб ВИЧ - для диагностики инфекции
Предыдущая часть
Глава I. Необходимость внедрения быстрых простых тестов в практику здравоохранения России
Внешний вид