Бесприборные тесты для диагностики ВИЧ-инфекции

Дробченко С.Н., Ривец Б., Сэмюэльс Ф., Бесприборные тесты для диагностики ВИЧ-инфекции, Журнал лабораторная диагностика, 2010, №3-4, стр. 29-31.

БЕСПРИБОРНЫЕ ТЕСТЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

к.х.н. Дробченко С.Н.тел.812-3252170, проф. Ривец Б., проф. Сэмюэльс Ф.

ЗАО «Биоград», Санкт-Петербург, Orgenics LTD, Израиль, Orgenics PBS, Франция http://www.biograd.ru ,

Резюме

В статье проанализированы результаты Российских государственных испытаний и испытаний ВОЗ экспресс-тестов на ВИЧ, поставлявшихся в рамках приоритетного национального проекта в сфере здравоохранения в 2007-2009 годах. Все из поставлявшихся тестов, за исключением теста ИммуноКомб были иммунохроматографическими. Испытания показывают, что тесты ИммуноКомб дают результаты близкие к классическим ИФА тестам на сероконверсионных панелях, а также обладают более высокой прогностической ценностью положительного результата, чем рассмотренные иммунохроматографические тесты.

Abstract:

The article analyses the results of Russian state trials and WHO reports about express tests for HIV, which were supplied as a part of priority national healthcare project in Russia in 2007-2009. All of the tests supplied, with the exception of ImmunoComb, were immunochromatographic tests. The trials have shown that ImmunoComb gives results close to classic ELISA tests on seroconversion panels and has a higher positive predictive value than the immunochromatographic tests.

В 2007-2009 годах в рамках Приоритетного национального проекта в сфере здравоохранения  для экспресс скрининга на наличие антител к ВИЧ в медицинские учреждения России поставлялись следующие бесприборные тесты для экспресс определения антител к ВИЧ: Ретрочек ВИЧ, Детермин ВИЧ-1/2, ИммуноКомб ВИЧ 1+2 БиСпот и ИХА-ВИЧ 1,2 -Фактор. Эти тесты могут проводиться в лабораториях, клиниках, машинах медицинских служб, кабинетах врачей и т.п.

Цель: В данной статье проанализированы результаты Российских государственных испытаний указанных выше тестов и приведены данные ВОЗ. Исходя из приведенных данных по чувствительности, специфичности тестов и распространённости ВИЧ в России, рассчитана прогностическая ценность положительного результата (PPV) теста.

Методы: Тесты Ретрочек ВИЧ, Детермин ВИЧ-1/2, ИХА-ВИЧ 1,2 -Фактор основаны на принципе иммунохроматографии (ИХА). ИХА-тесты выполнены в виде тест-полоски или тест-кассеты. Принцип действия ИХА-теста состоит в том, что физиологическая жидкость, нанесенная на тест-полоску или тест-кассету начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость. Анализируемый образец сыворотки (плазмы) или цельной крови всасывается поглощающим участком тест-кассеты. Кроме линии, содержащей антигены к ВИЧ, полоски обычно снабжаются контрольной линией, обеспечивающей регистрацию иммуноглобулинов класса G.

Для проведения анализа на ИХА-тестах вносится 1-2 капли (примерно 25-50 мкл) сыворотки или плазмы в область образца тестовой кассеты, далее добавляется 1 капля буфера (примерно 40 мкл) и через 10-20 минут получается результат. Наличие видимых линий в тестовой и контрольной позициях означает положительный результат, появление только контрольной линии свидетельствует об отрицательном образце, отсутствие контрольной линии указывает на недействительность теста. Не допускается считывание результата после 20 минут, так как окраска линий не стабильна. К преимуществам данных тестов относится получение результата в течение 10-20 минут, возможность использования без дополнительного оборудования, хранение при комнатных условиях. Однако иммунохроматографические тест-полоски не лишены недостатков. Касается это надежности, чувствительности и экономичности тестов. Надежность и чувствительность зависит, во-первых, от качества используемых в тесте реагентов и, во-вторых, от концентрации антигена в биоматериале. Качество используемых реагентов зависит от способов их получения, очистки и фиксации на полоске. Концентрация антигена – от стадии заболевания и количества биоматериала.

Тесты ИммуноКомб ВИЧ 1+2 БиСпот выполнены в оригинальном формате ИммуноГребней. Такой формат, с твердой фазой иммуноферментного анализа, расположенной на выступах-зубцах полимерного Гребня, позволяет переносить твердую фазу между растворами реагентов, необходимых для проведения ИФА.

Отличительной особенностью тестов ИммуноКомб ВИЧ 1+2 БиСпот является проведение полноценного иммуноферментного анализа (ИФА) без использования оборудования.

Наименование БиСпот означает двухточечный - по наличию двух раздельных точек на антитела к ВИЧ‑1 и к ВИЧ‑2 на каждом зубце Гребня. В тесте предусмотрен также внутренний контроль (третья точка), подтверждающий достоверность проведенного анализа и сохранность реагентов во время транспортировки и хранения. Все необходимые реагенты: разбавитель образца, промывочные растворы, конъюгат, помещены производителем в лунки планшеты - Проявочной Ванны. В отличие от классического ИФА, где в лунки планшеты, содержащей твердую фазу анализа, последовательно заливаются необходимые реагенты, перенос твердой фазы между лунками планшеты, содержащей готовые растворы, значительно проще осуществлять вручную, без использования дорогостоящего оборудования. Это позволило фирме Орженикс создать тест, воспроизводящий классический ИФА без использования оборудования за меньшее время (36 минут) и с возможностью индивидуального анализа. Для обеспечения высокой чувствительности тестов ИммуноКомб подобрана реакция связывания с использованием фосфатазно-щелочного конъюгата. Французское агентство по контролю за медикаментами (ADA), оценивая тесты, разрешенные для использования в клиниках Европы, подчеркивает, что использование фосфатазно-щелочного конъюгата позволяет достичь наиболее высокой чувствительности по сравнению с тестами, основанными на пероксидазной реакции. Результаты анализа проявляются в виде серо-голубых точек на зубцах Гребня, при этом окраска формируется на твердой фазе и стабильна после остановки реакции, что позволяет документировать результаты анализа. Формирование окрашенного комплекса антиген-антитело непосредственно на твердой фазе увеличивает чувствительность теста и облегчает промывку от неспецифических взаимодействий.

Для проведения анализа образец (сыворотка или плазма крови) в количестве 50 мкл вносится в ячейки первого ряда Проявочной Ванны. Анализ проводится переносом Гребня из одного ряда Проявочной Ванны в другой с инкубацией на каждом шаге. Результаты анализа проявляются через 36 минут в виде окрашенных точек на зубце. Появление только верхней точки (внутренний контроль) указывает на то, что исследуемый образец не содержит антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Появление на зубце вместе с верхней средней точки указывает на присутствие в образце антител к ВИЧ‑2. Круглая окрашенная нижняя точка указывает на присутствие в образце антител к ВИЧ‑1.

Технология ИммуноКомб специально разрабатывалась для выявления антител на ранних стадиях сероконверсии. При синтезе и нанесении антигенов на твердую фазу (зубцы Гребня) были учтены особенности первых антител, которые отличаются от антител, образующихся на более поздних стадиях иммунного ответа (различные изотипы синтезированных антител, различная аффинность и авидность, направленность на различные эпитопы антигенов).

Тесты ИммуноКомб сочетают достоинства ИФА - высокую чувствительность (100%) и специфичность (99,7%), с достоинствами ИХА - простотой и быстротой постановки анализа, возможностью индивидуального тестирования.

Результаты и обсуждение: Российские государственные испытания [1] показали, что ИФА тест ИммуноКомб II ВИЧ 1+2 БиСпот выявляет антитела к ВИЧ во всех образцах сероконверсионной панели BBI HIV 9017, начиная с 6-го, ИХА тесты Детермин ВИЧ 1/2, Serodia ВИЧ 1/2, Genie ВИЧ 1/2- с 10-го образца, ИХА тест Ретрочек ВИЧ - с 9-го образца, тесты ИХА-ВИЧ 1,2 -Фактор в испытаниях не участвовали. По данным BioClinical Partners (США) [2] - производителя сероконверсионной панели BBI HIV 9017, ИФА тест-системы производства Abbot и Roche выявляют антитела к ВИЧ с 7 -го образца данной панели, производства Organon - с 9-го образца.

В соответствии с данными [2] о дате забора образцов данной сероконверсионной панели, ИФА тест Иммунокомб II ВИЧ 1+2 БиСпот  выявляет антитела к ВИЧ на 11-15 дней раньше чем  экспресс-тесты, основанные на принципе иммунохроматографии, и на 4-11 дней опережают планшетные ИФА тест-системы известных зарубежных производителей.

Таким образом применение тестов ИммуноКомб II ВИЧ 1+2 БиСпот для экспресс - скрининга на ВИЧ обеспечивает сокращение периода окна, что особенно важно при обследовании доноров и профилактике вертикальной передачи ВИЧ от матери к ребенку.

Испытания, проведенные ВОЗ [3]  на сероконверсионных панелях показали, что тест ИммуноКомб II ВИЧ 1+2 БиСпот выявляет антитела к ВИЧ-1 на 8,5 дней раньше референс-теста Enzygnost Anti-HIV 1/2 Plus. Тесты Детермин  и Ретрочек выявляли антитела позже референс теста. Данные по испытаниям ВОЗ тест-систем  ИХА-ВИЧ 1,2 -Фактор отсутствуют. По результатам испытаний ВОЗ, чувствительность тестов ИммуноКомб, Детермин, Ретрочек составляет 100%, специфичность тестов ИммуноКомб II ВИЧ 1+2 БиСпот ( 99,7% ) превосходит специфичность тестов Детермин ВИЧ ( 99,4% ) в два раза, специфичность тестов Ретрочек ВИЧ ( 99,1% ) в три раза (количество ложноположительных результатов 0,3%, 0,6% и 0,9% соответственно).

В таблице представлены значения PPV (прогностическая ценность положительного результата), рассчитанные в зависимости от  распространенности ВИЧ-инфекции .

Таблица: PPV экспресс-тестов при различной распространенности ВИЧ

Для значений распространенности 0,01% и 6,00% в таблице приведены данные PPV, указанные в отчетах ВОЗ [3]. Для остальных значений распространенности PPV рассчитаны по формуле, используемой ВОЗ.

При среднем по России уровне распространенности ВИЧ (0,30%) прогностическая ценность положительного результата у тестов ИммуноКомб II ВИЧ 1+2 БиСпот составляет 50%, у тестов Детермин ВИЧ 1/2 — 33%, у тестов Ретрочек ВИЧ — 25%. Это означает что количество подтверждающих тестов, необходимых при работе с тест-системами ИммуноКомб II ВИЧ 1+2 БиСпот будет в полтора раза меньше, чем при работе с тест-системами Детермин ВИЧ ½ и в два раза меньше, чем при работе с тестами Ретрочек ВИЧ.

Выводы: Применение тестов ИммуноКомб II ВИЧ 1+2 БиСпот для экспресс скрининга на ВИЧ обеспечивает сокращение периода окна, минимизацию ложноположительных результатов, которые особенно нежелательны при назначении химиопрофилактики при родах и в период новорожденности.

1. Отчет о сравнительных испытаниях диагностических тест-систем для выявления антител  к ВИЧ, разрешенных к применению в РФ, МЗРФ 22.03.04, таблица 24.
2. BioClinical Partners Inc., Franklin, MA, 02038, USA Seroconversion Panel Catalog no. HIV 9017.
3. World Health Organization. HIV Assays: Operational Characteristics Report 16 / Simple/Rapid tests; Geneva: WHO, 2009, Annex 2, p.38.