4.1.1. Количественное определение IgG к Н.Pylori иммуноферментным БПТ ИммуноКомб

Количественное определение антител IgG к H.Pylori в сыворотке, плазме, цельной крови следует проводить с помощью иммуноферментного Быстрого Простого Теста ИммуноКомб H.PYLORI IGG. Набор содержит все необходимые для проведения анализа реагенты, не требует дополнительного оборудования, позволяет проводить от 1 до 36 анализов одновременно, время анализа – 1 час.

В наборе Иммунокомб H.PILORI IGG использован метод косвенного твердофазного иммунофементного анализа (ИФА). Твердой фазой является гребень с 12 зубцами.

В начале анализа образцы сыворотки или плазмы предварительно разбавляют в отношении 1:11 и добавляют к растворителю в ячейках ряда A Проявочной Ванны. Затем в ячейки ряда A вставляют Гребень. Антитела к H.Pylori, если они присутствуют в образце, специфически связываются с антигенами H.Рylori на нижней точке зубца Гребня (Рисунок 1). Одновременно иммуноглобулины, присутствующие в образце, будут захвачены анти-человеческими иммуноглобулинами на верхней точке (Внутренний контроль). Не связанные компоненты смываются в ячейках ряда B. В ячейках ряда C анти-H.Рylori IgG, захваченные на зубцах, будут взаимодействовать с анти-человеческими IgG антителами, мечеными щелочной фосфатазой. В следующих двух рядах ячеек несвязавшиеся компоненты удаляют промывкой. В ячейках ряда F связанная щелочная фосфатаза взаимодействует с хромогенными компонентами. Результаты реакции наблюдают в виде серо-голубых точек на поверхности зубца Гребня.

Рисунок 1. Принцип анализа

В набор входит Положительный Контроль (анти-H.Рylori IgG) и Отрицательный Контроль, которые используют при анализе каждой группы образцов. По завершении анализа, на зубце с Положительным Контролем появляются две серо-голубые точки. На зубце с Отрицательным Контролем должна появиться верхняя точка, а нижней точки либо нет, либо она слабо окрашена. Верхняя точка проявляется на всех зубцах, подтверждая, что образец был внесен.

Состав набора

Гребни

Набор содержит 3 пластиковых Гребня. Каждый Гребень имеет по 12 зубцов, по зубцу на каждый тест (Рисунок 2). Каждый зубец сенсибилизирован в двух чувствительных областях:

• верхняя точка - козьими антителами на человеческий иммуноглобулин (Внутренний Контроль)
• нижняя точка - инактивированными антигенами Helicobacter Рylori.

Рисунок 4. Разделение Гребня на части

Примечание: Не удаляйте фольгу, покрывающую проявочную ванну. Вскрывайте фольгу только в соответствии с указаниями инструкции по проведению анализа с помощью сменного наконечника пипетки или перфоратора.

Подготовка Гребня

Внимание: Чтобы обеспечить правильное функционирование теста, не прикасайтесь к зубцам Гребня.

Разорвите алюминиевую упаковку Гребня у надсеченного края. Извлеките Гребень. Вы можете использовать Гребень и Проявочную Ванну целиком, либо использовать только часть Гребня и ячеек Проявочной Ванны. Чтобы использовать часть Гребня:

• Подсчитайте, сколько зубцов вам потребуется для анализа образцов и контролей. Вам потребуется по одному зубцу на анализ. На каждом зубце изображен кодовый номер набора "25" для того, чтобы всегда можно было определить к какому набору принадлежит отдельный зубец.
• Согните гребень по вертикали и сломайте, или отрежьте ножницами (смотри Рисунок 4), чтобы отделить требуемое число зубцов (число анализов + 2 контроля).
• Верните неиспользуемую часть Гребня в алюминиевую упаковку (вместе с мешочком влагопоглотителя). Плотно закройте упаковку, например, канцелярской скрепкой, чтобы избежать проникновения влаги. Храните Гребень в оригинальной коробке набора при температуре 2-8 ^oC до дальнейшего использования.

Подготовка к анализу

Анализ следует проводить при комнатной температуре (22-26 ^oС)

Подготовка Проявочной Ванны

Проявочную Ванну следует выдержать в термостате при температуре 37 ^oC в течение 20 минут или оставить при комнатной температуре (22-26 ^oС) в течение 3-х часов. Застелите рабочий стол фильтровальной бумагой, которая после окончания работы должна быть уничтожена как биологически опасные отходы. Перемешайте реагенты, встряхивая Проявочную Ванну.

• Лабораторный таймер или часы.
• Микропробирки или планшеты ячеек микротитра.

Хранение наборов

Наборы следует хранить в оригинальной упаковке при температуре 2-8 ^oС. При этих условиях набор остается стабильным до конца срока хранения, указанного на этикетке. Не замораживайте набор.

Сбор образцов

Можно анализировать либо сыворотку, либо плазму. Образцы перед анализом можно хранить до 7 дней при температуре 2-8 ^oC. Для более длительного хранения образцы должны быть заморожены до температуры -20 ^oC или ниже.

После оттаивания образцы следует отцентрифугировать. Анализируйте надосадочную жидкость. Избегайте повторных замораживаний и оттаиваний.

При экстренных анализах можно использовать цельную пальцевую кровь, в количестве в 2 раза превышающем количество сыворотки или плазмы, указанном ниже.

Процедура Анализа

Необходимое оборудование:

Прецизионные пипетки со сменными наконечниками с объемами 10, 25 и 100 мкл. Ножницы.

Рисунок 3. Проявочная Ванна

Контроли

Положительный Контроль - 1 флакон (красная крышка), 0.2 мл инактивированной нагреванием человеческой плазмы, разведенной до порогового уровня 20 Ед/мл анти-H. pylori IgG.

Отрицательный Контроль - 1 флакон (зеленая крышка), 0.2 мл разбавленной инактивированной нагреванием человеческой плазмы отрицательной по анти-H.pylori.

Разбавитель образца - 1 флакон (прозрачная крышка), 5 мл. раствора.

Перфоратор - для прокалывания алюминиевой фольги, покрывающей ячейки Проявочной ванны.

Шкала CombScale™ - для считывания результатов анализов

Меры предосторожности

Набор предназначен для использования in vitro. Не смешивайте реагенты разных наборов. Не используйте наборы с истекшим сроком годности.

Рисунок 2. Гребень

Гребни поставляются в алюминиевых упаковках, содержащих мешочек с влагопоглотителем.

Проявочные Ванны

В наборе - 3 Проявочных Ванны, покрытых алюминиевой фольгой. Каждая Проявочная Ванна (Рисунок 3)содержит все реагенты, необходимые для проведения анализа. Проявочная Ванна состоит из 6 рядов (A-F) по 12 ячеек в каждом. Содержимое каждого ряда:

Ряд A - растворитель образца Ряд B - промывочный раствор Ряд C - козьи анти-человеческие IgG антитела, меченные щелочной фосфатазой Ряд D - промывочный раствор Ряд E - промывочный раствор Ряд F - раствор окрашивающего вещества, содержащий 5-бром-4хлор3-индолил фосфат (BCIP) и нитро синий тетразол (NBT)