4.1.1. Принцип анализа

В технологии ИммуноКомб реализован принцип твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) в различных его вариантах. Например, для обнаружения антител к ВИЧ 1+2 и вирусу гепатита С применен непрямой метод ИФА, а для выявления HBsAg – “сэндвич” вариант. В качестве твердой фазы использован пластиковый гребень с 12 зубцами (Рис. 1).

Рисунок 1. Гребень Иммунокомб

Каждый зубец сенсибилизирован известными специфическими антигенами (АГ) или антителами (АТ) в двух или трех точках:

• верхняя точка - АТ к человеческому IgG (внутренний контроль),
• средняя и/или нижняя точка - специфическими АГ или АТ.

Проявочная ванна (Рис. 2) имеет 6 рядов (A - F) c 12 лунками в ряду. В лунках каждого ряда содержатся растворы веществ, готовые к употреблению на различных этапах проведения исследования.

Рисунок 2. Проявочная Ванна

Содержание каждого ряда:

• Ряд A - растворитель образца,
• Ряд B - промывочный раствор,
• Ряд C - специфические реагенты, меченые щелочной фосфатазой,
• Ряд D - промывочный раствор,
• Ряд E - промывочный раствор,
• Ряд F - раствор окрашивающего вещества, содержащий 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат (BCIP) и нитро синий тетразол (NTB)

В начале анализа образцы искомой сыворотки или плазмы помещают в раствор для разведения в лунках ряда А проявочной ванны. Затем в лунки ряда А опускают гребень.

Анализ проводят шаг за шагом, перемещая гребень из одного ряда в другой и инкубируя его на каждом этапе (Рис. 3).

Рисунок 3. Этапы анализа

• В ряд А ванночки вносятся образцы (сыворотка, плазма или цельная кровь) и контроли.
• Гребешок вставляется в ряд А и инкубируется (реакция антиген-антитело).
• Гребешок перемещается из ряда в ряд ванночки в соответствии с инструкцией (промывки и связывание с коньюгатом). Цветная реакция в ряду F.
• Результат анализа в виде окрашенных точек.
  
  • Верхняя точка: внутренний контроль. Должна присутствовать и при положительных и при отрицательных образцах. Она подтверждает правильность работы тест-системы.
  • Нижняя точка (одна или две) появляется в случае наличия инфекции.
• Уровень видоспецифичных антител в каждом образце оценивается количественно с помо щью цветной шкалы КомбСкейл, входящей с состав набора.
• Для индивидуального тестирования гребешок можно согнуть и отломить необходимое количество зубцов. В ванночке вскрывается соответствующее числу зубцов количество ячеек. Невскрытые ячейки и неиспользованные зубцы хранятся в течение срока годности тест-системы.

Рисунок 4. Принцип анализа.

Искомые АТ (рис.4), если они есть в исследуемой сыворотке (плазме), избирательно свяжутся с соответствующими специфическими АГ, фиксированными в средней и/или нижней точке зубца (реакция антиген-антитело). Одновременно пойдет реакция образования иммунного комплекса в верхней точке зубца (внутренний контроль). Не связавшиеся (неспецифические) компоненты смываются в лунках ряда В. Специфически связавшиеся компоненты далее, в лунках ряда С, будут реагировать с компонентами, меченными ферментом щелочной фосфатазой (связывание с коньюгатом). В следующих рядах ячеек не связавшиеся компоненты удаляют промывкой. В лунках ряда F связанная (на зубце) щелочная фосфатаза взаимодействует с хромогенными компонентами. Результаты реакции наблюдаются в виде серо-голубых точек на поверхности зубца гребня.