Глава XII. Подтверждающие тесты

к.х.н. Дробченко С.Н., проф. Кальво А., проф. Сэмюэльс Ф.,

ЗАО «Биоград» Санкт-Петербург; Orgenics PBC, Франция; Orgenics LTD Израиль

Алгоритм ВИЧ-тестирования для получения окончательного ответа включает предварительный скрининг и последующие подтверждение результата (рис 11). Для скрининга применяются ИФА-тесты, обладающие максимальной чувствительностью и высочайшей величиной NPV (предсказание отрицательности - вероятность того, что образец не содержит ВИЧ антитела, когда тест дает отрицательный результат).

Подтверждающие тесты, прежде всего, предназначены для определения достоверности полученного в ходе скрининга результата среди изначально ИФА-реактивных образцов, поэтому они должны показывать максимальную специфичность и самую высокую величину PPV (предсказания позитивности - вероятность того, что образец содержит ВИЧ антитела, когда тест дает положительный результат).

Рисунок 11. Алгоритм анализа ВИЧ

Частица ВИЧ состоит из геномной молекулы ДНК связанной с обратной транскриптазой и защищенной капсидой и оболочкой. Оболочка вируса является основной мишенью антител гуморального отклика на инфекцию. Поэтому большая часть высокочувствительных скрининговых тестов основана на обнаружении антител к антигенам, полученным из компонентов оболочки (env) вируса.

Для того, чтобы отличить истинные положительные результаты скрининговых тестов от ложных, следует проводить повторный анализ с использованием подтверждающего теста, имеющего более высокую специфичность, чем скрининговые. Наиболее часто используемый для этих целей Вестерн Блот представляет собой нитроцеллюлозную мембрану, на которую нанесены электорофоретически разделенные белки ВИЧ. В результате многоступенчатого ИФА на мембране проявляются в виде отдельных полос все главные белковые цепочки, закодированные тремя структурными генами ВИЧ (gag, pol и env). Антитела сыворотки избирательно связываются с разными протеинами ВИЧ согласно их специфичности (рисунок 11). Вестерн Блот, являющийся первым принятым подтверждающим ВИЧ методом, принят за Золотой стандарт. Однако, в сравнении с сильно упрощенными ИФА тестами, Вестерн Блот остается более длительным и сложным в постановке анализом. Фирмой Orgenics (Франция, Израиль) был разработан быстрый простой подтверждающий тест ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм. В наборе ВИЧ 1+2 КомбФирм для быстрого серологического определения профиля ВИЧ антител используется пять индивидуальных рекомбинантых и синтетических ВИЧ антигенов. Из них два – протеины, полученные из ферментов вируса (pol)и ядра (gag) - реактивны по обоим типам ВИЧ; остальные три антигена - пептиды или гликопротеиды, производные структурных белков (env), - специфичны по ВИЧ-1 либо по ВИЧ-2. Антигены в определенной концентрации нанесены в индивидуальных позициях и свободны от тканевых антигенов, которые обычно загрязняют препараты из вирусных лизатов, обычно используемых в Вестерн Блот. Результаты анализов с помощью ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм сопоставимы с результатами, получаемыми методом Вестерн Блот. Вместо того, чтобы проделывать два, занимающих много времени анализа Вестерн Блот, можно провести подтверждающий анализ на антитела к ВИЧ типов 1 и 2 с помощью одного быстрого и простого теста КомбФирм.

ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм - это метод рекомбинантного иммуноблота, основанного на непрямом твердофазном иммуноферментном анализе. Твердой фазой является гребень с 6-ю парами зубцов, с шестью точками на каждой паре (по 3 точки на каждом зубце). Верхняя точка левого зубца сенсибилизирована человеческими иммуноглобулинами (внутренний контроль); средняя - рекомбинантным белком p24(gag ВИЧ 1 и ВИЧ 2); нижняя - рекомбинантным антигеном p31 (pol ВИЧ 1 и ВИЧ 2). На правый зубец нанесены: рекомбинантный гликопротеин gp120 (env ВИЧ 1), синтетический пептид gp41 (env ВИЧ 1),синтетический пептид gp36 (env ВИЧ 2) (рисунок 12).

Рисунок 12.

Рисунок 13. Результаты анализов подтверждающих тестов

Проявочная Ванна имеет 6 рядов (A - F), каждый ряд содержит готовые к использованию растворы реагентов для различных стадий анализа (рисунок 1). Анализ проводят в несколько этапов. Гребень последовательно переносят из одного ряда ячеек в другой с инкубацией на каждом этапе.

Рисунок 14. Проявочная ванна

Перед началом анализа образцы сыворотки или плазмы добавляют к растворителю в ячейках ряда A Проявочной Ванны. Затем в ячейки ряда A вставляют Гребень. Анти-ВИЧ антитела, если они присутствуют в образце, специфически связываются с ВИЧ антигенами на зубцах Гребня. Иммуноглобулины, присутствующие в каждом образце, связываются с античеловеческими IgG в верхней контрольной точке левого зубца (Внутренний Контроль) (Рисунок 15). Несвязанные компоненты смываются в ячейках ряда B. В ячейках ряда C анти-ВИЧ IgG и человеческий иммуноглобулин, связанные с точками зубцов, будут взаимодействовать с анти-человеческими IgG антителами мечеными щелочной фосфатазой (alkaline phosphatase AP). В следующих двух рядах ячеек не связавшиеся компоненты удаляют промывкой. В ячейках ряда F связанная щелочная фосфатаза взаимодействует с хромогенными компонентами. Результаты анализа наблюдают в виде серо-голубых пятен на поверхности зубцов Гребня, проявляющихся в зависимости от наличия в исследуемом образце специфических антител (рисунок 15).

Рисунок 15. Принцип анализа КомбФирм

В набор входит Положительный Контроль (антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2) и Отрицательный Контроль которые необходимо ставить при анализе каждой группы образцов. По завершению анализа, на зубцах с Положительным Контролем должны проявиться шесть (по три на каждом) серо-голубых точек. На зубце с Отрицательным Контролем должна появиться только верхняя точка на левом зубце. Интерпретация анализа ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм представлена в таблице 33.

Таблица 33. Интерпретация результатов анализа ВИЧ 1+2 КомбФирм

*) Во всех образцах и контролях должно проявиться верхнее пятно левого зубца (внутренний контроль), в противном случае результаты анализа недействительны и анализ следует повторить.

Как видно, ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм прост в обращении и интерпретации результатов. Если проявится только одна точка внутреннего контроля, то результат теста отрицательный. Две или более точки (включая, по крайней мере, один структурный белок оболочки env) указывают на ВИЧ 1 и / или ВИЧ 2 инфекцию. Остальные результаты считаются неопределенными.

Исследования, проведенные в Израиле, Франции, Бельгии, Бразилии и Сенегале (таблица 34), показали, что ВИЧ 1+2 КомбФирм позволяет получать быстрые результаты со 100% чувствительностью и специфичностью и корректно дифференцирует ВИЧ 1 и ВИЧ 2 в 85.6% случаев. Тест-система может также определить все субтипы 0 образцов ВИЧ 1 985 образцов, идентифицированных хотя бы по одному из двух тестов ELISA третьего поколения, как положительные по ВИЧ-1 и /или ВИЧ-2, были повторно исследованы на подтверждающих тестах ВИЧ 1+2 КомбФирм, а затем Вестерн Блот для ВИЧ-1 (Cambridge Biotech) и для ВИЧ-2 (BioGenex).

Таблица 34. Совокупные, по нескольким центрам, результаты клинических испытаний набора КомбФирм.

Была также доказана высокая надежность тест-систем ВИЧ 1+2 КомбФирм, показавшей 100% величину предсказания позитивности, при определении этой величины, среди популяции с низким уровнем распространенности ВИЧ (менее 0.01%).

Клиническая ценность тест-систем ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм была изучена в Бельгии при сравнительных испытаниях с Вестерн Блот. Критерием оценки служила корректность интерпретации неопределенных результатов.

Для исследования анализировали 4 группы образцов:

• 50 образцов положительных по ELISA, получивших положительное подтверждение по Вестерн блот.

  Эта группа определяет чувствительность теста, а именно: отношение количества образцов, идентифицированных как положительные, к общему количеству положительных образцов.

• 50 образцов, отрицательных как по ELISA так и по Вестерн блот.

  Эта группа определяет специфичность теста, а именно: отношение количества образцов, идентифицированных как отрицательные, к общему количеству отрицательных образцов.

• 50 образцов положительных по ELISA и неопределенных по Вестерн Блот.
• 50 образцов положительных по ELISA и отрицательных по Вестерн Блот.

Группы 3) и 4) соответствуют реальной лабораторной ситуации, когда проводят подтверждающие проверки ELISA положительных образцов. Поэтому эти группы объединены в одну. В этой группе Вестерн Блот определил только 50 образцов как отрицательные, ВИЧ 1+2 КомбФирм выявил 66 образцов как действительно отрицательные, что затем было подтверждено другими методами. Это ясно указывает на то, что ВИЧ 1+2 КомбФирм превосходит Вестерн Блот в предсказательной силе истинно отрицательных образцов, демонстрируя высокую специфичность.

Проведенные исследования показали, что ВИЧ 1+2 КомбФирм уменьшает на 56% число повторных анализов по сравнению с Вестерн Блот, отсеивая ложно неопределенные результаты.

Внедрение ВИЧ 1+2 КомбФирм может повысить эффективность использования ВИЧ-подтверждающих тестов по следующим причинам:

• Обеспечивает максимальную безопасность персонала от заражения использованием при производстве специфических рекомбинантных и синтетических белков,.
• Оптимальная комплектация тест-систем, исключет использование дополнительного оборудования и стадию подготовки растворов.
• Высокая точность, быстрота и гибкость теста.

Последние две причины особенно существенны для небольших медицинских учреждений, получающих с оснащением наборами ВИЧ 1+2 КомбФирм возможность проводить референс исследования.

В таблицах 35, 36 приведены параметры тестов иммуного блота для выявления ВИЧ инфекции.

Таблица 35. Сравнение Вестерн Блот и КомбФирм

Таблица 36. Коммерческие наборы для подтверждения ВИЧ инфекции

Как видно из таблиц 35, 36 тесты ИммуноКомб являются безопасными, надежными, удобными и быстрыми тестами, подтверждающими наличие антител к ВИЧ в крови. К их преимуществам также относят непродолжительное время проведения анализа, возможность визуального учета реультатов реакции, наличие внутреннего контроля постановки анализа и т. п.. Приказом №292 от 30.07.2001 тесты «ИммуноКомб II ВИЧ 1+2 КомбФирм» рекомендованы для постановки окончательного лабораторного диагноза и подтверждения наличия антител к ВИЧ методом иммуного блота (также см. главу VII).

Демонстрация позитивных характеристик тест-системы ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм должна способствовать внедрению песледней в практику лабораторных анализов в качестве подтверждающего теста.