Глава VIII Быстрые и простые методы определения маркеров инфицирования вирусами гепатитов в системе лабораторной диагностики этих инфекций

д.м.н., проф., член-кор. РАЕН Михайлов М.И., Руководитель лаборатории индикиции ГУ института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Руководитель отдела вирусных гепатитов ГУ института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН

Прогресс в исследовании и профилактике большинства инфекционных заболеваний во многом определяется разработкой и внедрением новых методов лабораторной диагностики. Не исключением являются вирусные гепатиты. Применение иммунохимических методов детекции антигенов и антител (реакция преципитации в геле) позволило идентифицировать «Австралийский антиген» (HВsAg), основной маркер вируса гепатита В (Б. Бламберг, 1964 г.). Обнаружение этого антигена открыло новую эпоху этиологической расшифровки вирусных гепатитов. Вслед за выявлением вирусов гепатита В, А, Е, D и С, при помощи появившихся новых методов молекулярной диагностики идентифицированы новые вирусы (вирус гепатита G; TTV и SEN), которые ответственны за развитие гепатитов, обозначаемых ранее как - гепатиты «НИ А, НИ В».

Для выявления серологических маркеров (антигены и антитела к ним) инфицирования вирусами, ответственными за развитие гепатитов, используются различные методы и диагностические препараты, изготовленные отечественными и зарубежными производителями. В самом общем виде, требования, предъявляемые к методам и диагностическим препаратам, могут быть сформулированы как:

• чувствительней;
• специфичней;
• быстрее;
• проще;
• дешевле.

К большому сожалению, удовлетворить всем этим требованиям в одном препарате не удается. Тем не менее, именно стремление к максимально полному их удовлетворению определяет прогресс в разработке новых методов и диагностических препаратов. От момента открытия НВsAg до настоящего времени произошла эволюция диагностических препаратов, направленная, в первую очередь, на повышение их чувствительности и специфичности. Факторы, определяющие эту эволюцию, представлены на рисунке 5.

Рисунок 5.

Значимость инфекции для общества:

Опасность вирусных гепатитов для мира и России трудно переоценить. Она определяется высокой заболеваемостью и смертностью, поражением лиц молодого возраста, частой хронизацией (при гепатите С – 70 -80 % случаев острого гепатита С). Вирусы гепатита В и С являются этиологическими агентами первичного рака печени.

Особенно остро проблема вирусных гепатитов В и С встала перед нашей страной в конце 90-х годов ХХ века. Данные официальной регистрации острого гепатита В и С представлены на рисунке 6.

Рисунок 6. Заболеваемость острым гепатитом в и с в российской федерации в 1992-2003 г.г.
(в показателях на 100 тыс. Населения)

Резкий подъём заболеваемости гепатитом В и С был определен бурным ростом наркомании (в первую очередь среди молодежи, принимающей наркотики внутривенно) и приходом сексуальной революции в Россию, что было отмечено появлением значительного количества носителей вирусов гепатита В и С среди лиц, занимающихся проституцией. Показатели заболеваемости гепатитом В и С среди жителей некоторых городов (например: Тольятти, Свердловск, Челябинск, достигали 150 – 200 на 100000 населения). Учитывая, что истинная заболеваемость вирусными гепатитами в 5 - 10 раз превышает официально регистрируемые данные, правомерно считать, что Россия находится в ситуации «скрытой эпидемии вирусных гепатитов».

В дальнейшем, в 2001 -2003 году произошло снижение заболеваемости гепатитами В и С. Причинами этого называют: практически полное поражение инфекцией лиц, принимающих наркотики, а также успехи в проведении профилактической работы, и в первую очередь, вакцинопрофилактики гепатита В. Казалось бы, что ситуация с вирусными гепатитами нормализуется. Однако это не так. Хорошо известно, что клинически хронические гепатиты В и С проявляют себя через 10 -15 лет после инфицирования. Исходя из этого, в ближайшее десятилетие можно предвидеть увеличение больных с клинически выраженным хроническим гепатитом. Эти процессы определяют переход в новую стадию «эпидемии вирусных гепатитов», что делает очевидным важность использования высокочувствительных и специфичных диагностических препаратов.

Прогресс в науке – создание новых методов детекции:

Развитие иммунологии и иммунохимии; появление новых полимерных соединений и открытия в молекулярной биологии; создание новых компьютеров и программных продуктов поставили лабораторную диагностику вирусных гепатитов на принципиально новый уровень. При этом наиболее значимым стало внедрение этих достижений в работу не только научно-исследовательских институтов, а, прежде всего, в работу лечебно-диагностических учреждений практического здравоохранения страны.

Открытие новых диагностических маркеров инфицирования вирусами гепатитов:

История развития диагностики вирусных гепатитов неразрывно связана с открытием новых маркеров инфицирования. В настоящее время немыслима постановка диагноза конкретного вирусного гепатита без обнаружения комплекса диагностических маркеров. Так, например, при гепатите В – определение НВsAg, IgM анти-НВс, HBeAg, анти-НВе, ДНК HBV, анти-НВs; IgG анти-НВс позволяет подтверждать «клинический» диагноз, осуществлять прогноз течения, эффективность лечения и вакцинопрофилактики гепатита В.

Повышенные стандарты качества, применяемые при создании и использовании диагностических препаратов:

В последние годы разработана система повышения требований, предъявляемым к диагностическим препаратам, и непосредственному проведению лабораторных исследований. Разработка национальных стандартных препаратов, контрольных панелей сывороток крови, применяемых как для оценки диагностикумов, так и в системе внешнего контроля качества лабораторных исследований.

Развитие диагностики вирусных гепатитов, так же как и при других инфекционных заболеваниях, развивается в двух основных направлениях:

Первое:Создание сложных, высокочувствительных технических комплексов. В их создание закладывалась главная конструкторская задача – обеспечение качества исследований за счет внедрения принципиально новых технических средств, позволяющих проводить исследования образцов при помощи высокоавтоматизированных систем. Лабораторные комбайны созданы такими известными фирмами, как: «Аввотт» (США); «Roche» (Швейцария) и др. Такие диагностические системы используются в крупных медицинских учреждениях для проведения массовых лабораторных исследований.

Второе: Создание экспресс тестов (менее часа), для осуществления которых не требуется специального оборудования, является одним из приоритетных направлений лабораторной диагностики. В диагностических препаратах, позволяющих учитывать результаты тестирования визуально, применяемых для диагностики вирусных гепатитов используется два варианта метода: иммунохроматография и дот-анализ.

Существуют два основных варианта метода: “flow through” (мембранный метод 1) и “lateral flow” (мембранный метод 2). Оба варианта метода основаны на взаимодействии тестируемого антигена с анти-НВs прочно сорбированного на нитроцеллюлозной мембране. Образовавшийся комплекс обнаруживают при помощи антисыворотки против HВsAg, меченной коллоидным золотом.

В мембранном методе № 1 применяется проточный вариант, когда исследуемая сыворотка крови и последующие реагенты реакции вносятся в лунку пластикового держателя, дном которого служит нитроцеллюлозная мембрана. Всасываясь в адсорбент, находящийся под мембраной, HBsAg вступает в реакцию с антителами и далее выявляется при помощи последовательно добавляемых реактивов. При наличии HВsAg на мембране образуется цветная точка, позволяющая судить о наличии искомого антигена. Наличие позитивного контроля позволяет судить об успешно осуществлённом исследовании.

При проведении мембранного метода № 2 все ингредиенты реакции (за исключением тестируемого образца) заранее адсорбированы на нитроцеллюлозной мембране. HBsAg диффундирует по поверхности мембраны, вступая в реакцию с анти-HBs и другими компонентами реакции. При наличии антигена в исследуемом образце образуется полоса, свидетельствующая о его наличии. Латеральное движение HВsAg по мембране позволяет помимо использования сыворотки крови для тестирования применять другие жидкости организма, включая цельную кровь.

В таблице 26 представлена сравнительная характеристика двух вариантов мембранных методов детекции HВsAg .

Таблица 26.

В Российской Федерации из диагностикумов, применяемых для безприборной детекции HВsAg нашел применение диагностический препарат – “Immunocomb HВsAg”, выпускаемый израильской фирмой “Orgenics”. Метод основан на принципе твердофазного ИФА. Применение смеси моноклональных антител к HВsAg, иммобилизованных на специальном пластике в виде зубцов (сomb). Этапы реакции осуществляются при последовательном переносе пластин с зубцами в специальные лунки, в которых находятся специальные растворы. Учет результатов осуществляется визуально, по наличию цветного пятна на зубце. Данный диагностический препарат позволяет выявлять антиген различных субтипов в концентрации 0,25 нг/мл и выше. Оценка диагностикума “ИммуноКомб HBsAg”, проведенная в нашей лаборатории, на стандартной панели сывороток производства Boston Biomedical Inc. (BBI PHA203) для определения чувствительности (концентрация HBsAg от 0,7 до 2,5 нг/мл), а также сероконверсионной панели сывороток с низким содержанием HBsAg (<0,1-> 2,7 нг/мл) - ВВ1 РНА902, подтвердила, что тест "ИммуноКомб HBsAg" обладает данной чувствительностью.

Определение HВsAg является важным элементом в диагностике и профилактике гепатита В. Остается незыблемым положение о необходимости использования максимально высокой чувствительности применяемых диагностических препаратов для его детекции. Вся история развития методов выявления HВsAg наглядно иллюстрирует стремление достичь максимальной чувствительности выявления этого антигена (таблица 27).

Таблица 27. Относительная чувствительность методов выявления HВsAg

Как видно из результатов, представленных в таблице, чувствительность быстрых, безприборных методов детекции HВsAg уступает чувствительности радиоиммунного и иммуноферментного анализа. При этом возникает как минимум три вопроса: каково распределение концентраций антигена среди бессимптомных носителей; оправданы ли дальнейшие работы по повышению чувствительности диагностических препаратов и что дает внедрение тест-систем с чувствительностью выше 0,1 нг/мл.

Частично ответ на эти вопросы дают результаты определения концентрации HВsAg, полученные во Франции в 1996-1997 годах при исследовании сывороток крови 484 бессимптомных носителей антигена [A.M. Courouce, 1998]. Результаты определения концентраций антигена представлены на графике (рисунок 7).

Рисунок 7. Доля лиц с различной концентрацией HВsAg среди 484 бессимптомных носителей поверхностного антигена вируса гепатита В.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что у большинства бессимптомных носителей HВsAg циркулирует в достаточно высоких концентрациях. Так, более 60% из них имели концентрацию антигена, превышающую 50 нг/мл. Вместе с тем, у части (около 4 %) носителей НВsАg может циркулировать в концентрациях меньше 0,5 нг/мл. Многолетние наблюдения за изменением соотношения лиц с высокой и низкой концентрацией HВsAg, проведенные в Италии (M.Rizzetto, 1996) и России (М.И.Михайлов с соавт.,2000), установили постепенное уменьшение количества доноров- носителей НВsАg с высокой концентрацией антигена в крови. Выявление случаев возникновения гепатита В после переливания «серонегативной» по НВsАg крови свидетельствует о необходимости дальнейших работ по созданию и внедрению в практическое здравоохранение методов детекции антигена, обладающих высокой чувствительностью с сохранением высокой специфичности.

В отличии от выявления НВsАg у бессимптомных носителей, у больных острым гепатитом В уровень концентраций антигена выше, что позволяет обнаружить антиген при использовании диагностических препаратов с чувствительность 0,5 нг/мл более чем у 95% больных гепатитом В в острым периоде заболевания.

Способность к быстрому и достаточно чувствительному выявлению НВsАg при помощи диагностического набора “ИммуноКомб HBsAg”, позволяет сократить риск передачи гепатита В в ситуациях, когда нет возможности осуществить тестирования антигена более чувствительными методами.

Не менее важной задачей является выявление анти- ВГС. В отличии от детекции НВsАg, для выявления анти-ВГС разрабатывались и применяются методы, основанные на взаимодействие антигенов ВГС (полученных при помощи рекомбинантной технологии или же благодаря химическому синтезу) с мечеными антителами. В таблице 27 представлена характеристика тест-систем для выявления анти-ВГС

Таблица 28. Диагностические препараты для выявления анти - HCV

Как видно из таблицы 28, для выявления анти-ВГС применяются антигены кодированные различными зонами РНК ВГС. Тест "ИммуноКомб anti-HCV" прост в использовании и позволяет дифференцированно определять антитела к ядерному и неструктурным (NS3 +NS4+NS5) белкам вируса ГС. Помимо качественного результата тестирования анти-ВГС (есть или нет анти-ВГС) этот тест позволяет определить ранние аnti- NS3 и anti- NS4 антитела так же хорошо, как и anti-HCV core антитела, которые разнесены в разные точки на гребне, что играет главную роль в обнаружении в ранней стадии вируса гепатита С.Предоставляемая возможность раздельного тестирования антител к ВГС позволяет получить информацию важную для врача для разграничения острого и хронического гепатита С.

При проведении сравнительных испытаний диагностических препаратов для выявления анти-ВГС (2002 год) были получены противоречивые результаты, отметившие несколько меньшую чувствительность теста " ИммуноКомб anti-HCV" по сравнению с ELISA тестами. В то же время, проведенное нами изучение чувствительности и специфичности этого теста на специальной панели производства ВВI (ВВI РНА204) и сероконверсионной панели (ВВI РНА905) показало высокую диагностическую ценность теста. Так, анти-ВГС с помощью " ИммуноКомб anti-HCV" были впервые зарегистрированы на 11 день заболевания, т.е. на очень ранних сроках.

Одной из чрезвычайно важных задач лабораторной диагностики вирусных гепатитов является этиологическая расшифровка острых случаев . Этот вопрос важен, так как, именно от ответа на него зависит тактика лечения и осуществления профилактических мероприятий. Первым, и наиболее ответственным этапом этой работы является разграничение острого гепатита А (гепатита с фекально-оральным механизмом передачи возбудителя) с острым гепатитом В и С (гепатитов с парентеральной передачей возбудителя).

Как хорошо известно, при гепатите А отсутствует бессимптомное носительство вируса и развитие хронического гепатита. Единственным источником вируса является больной острым гепатитом А, что определяет важность ранней лабораторной диагностики острого периода заболевания. Особое место в диагностике занимает определение антител к антигену вируса гепатита А, класса IgM. Обязательное их присутствие при всех случаях гепатита А определяет правомерность их обозначения как - «золотой маркер лабораторной диагностики гепатита А». Для выявления IgM аnti-HAV применяют диагностические наборы для ИФА, выпускаемые как отечественными, так и зарубежными производителями. Применение теста " ИммуноКомб IgM аnti-HAV " позволяет подтвердить диагноз «гепатит А». Не менее важным является возможность определения IgM анти-НВс, что помимо этиологической расшифровки острого гепатита В необходимо для оценки течения хронического гепатита В.

Современный период борьбы с вирусными гепатитами характеризуется началом массового применения вакцин против гепатитов В и А. На графике (рис.8) данные о количестве лиц, вакцинированных против гепатита В в России в 1996 -2002 годах.

Рисунок 8.

Представленные данные убедительно свидетельствуют о неуклонном росте числа лиц, вакцинированных против гепатита В. Несомненно, и в будущие годы их количество будет возрастать. В связи с проведением вакцинации против гепатита В возникает вопрос о лабораторном обеспечении массовой вакцинации. При этом необходимо осуществлять, как пред- так и пост-вакцинальный скрининг. Применение безприборного теста " ИммуноКомб аnti-HВs” позволяет проводить и эти исследования.

Не менее важная проблема – вакцинация против гепатита А и ее лабораторное обеспечение. Ситуация с вакцинопрофилактикой гепатита А несколько отлична от вакцинопрофилактики гепатита В. Помимо плановой вакцинации против гепатита А возможна и вакцинация по экстренным показанием. Вакцинация лиц, вовлеченных во вспышку гепатита А, на ранних этапах её развития позволяет защитить этих людей от инфекции. Исходя из высокой цены на вакцинный препарат (20-25 $ за одну дозу), вопросы предвакцинального скрининга занимают первоочередное положение. Доступность и высокая чувствительность теста " ИммуноКомб IgG аnti-HAV ” позволяют оперативно решить вопрос о необходимости вакцинации против гепатита А.

ВЫВОДЫ:

• Диагностические препараты " ИммуноКомб " для определения серологических маркеров гепатитов А, В, С отличаются чувствительностью и специфичностью, что, наряду с простотой, может способствовать их самому широкому использованию.
• Применение этих наборов позволяет решать вопросы по этиологической диагностике острых вирусных гепатитов.
• Использование диагностикумов " ИммуноКомб anti-HBs" и " ИммуноКомб IgG аnti-HAV ” в лабораторном обеспечении вакцинопрофилактики гепатита А и В позволяет оптимизировать этот процесс и более рационально использовать выделяемые финансовые средства.
• Диагностические препараты " ИммуноКомб " для выявления маркеров инфицирования вирусами гепатита В,С и А должны шире использоваться в органах практического здравоохранения.